文章转载自：中国医学文摘·皮肤科学

作者：加杨娥，任立汆，燕华玲，冶娟，王永，郭砚，哈筱梅，朱世文，王刚

人体的衰老与紫外线有着直接的关系。能到达地面的紫外线主要是UVA(占95% )和UVB(占5% )，但同等剂量的条件下，UVB辐射损伤比UVA大800～1 000倍，同时UVB辐射还具有遗传毒性。由此可见，对人体损伤最大的紫外线是UVB。黑枸杞富含丰富的多糖、花色苷、原花青素、酚酸和黄酮等活性成分，具有较强的抗氧化、抗衰老活性。本实验以Ha Ca T细胞为研究对象，建立UVB损伤模型，以黑枸杞水提物作为干预因素，旨在探讨黑枸杞水提物在UVB损伤Ha Ca T细胞模型中的抗氧化作用。

1材料与方法

1. 1材料

黑果枸杞购自青海德令哈市壹葉香茶行;Ha Ca T细胞株购自南京凯基生物科技发展有限公司;DMEM培养基和FBS购自GIBCO公司; MTS购自Pro-mega试剂公司; SOD，GSH-Px，CAT，MDA试剂盒均购自南京建成生物工程研究所;二氧化碳( CO2)培养箱购自上海力申科学仪器有限公司; IX71型Olympus倒置显微 镜 购 自Olympus;飞 利 浦TL20W/12紫 外 线UVB灯管购自上海杰图商贸有限公司。

1. 2黑枸杞水提物的制备

准确称取黑枸杞干果100g，加入蒸馏水500m L，煮沸2h，过滤，滤渣中加入同样的蒸馏水继续煮沸，重复3次，合并滤液，旋转蒸发仪浓缩，冷冻干燥获得黑枸杞水提物粉末。

1. 3细胞培养

向装有Ha Ca T细胞的培养瓶中加入含有10%胎牛血清和1%的双抗(链霉素和青霉素)的DMEM培养基，于37℃，5% CO2的饱和湿度条件下培养。当细胞达80%～90%融合时，进行传代，PBS液冲洗培养瓶底3遍，加入胰酶1. 5m L于培养箱中消化3min，当细胞变圆、间隙变大时，加入4～5倍的含FBS的DMEM培养基终止细胞消化，收集细胞悬液离心，按1∶3比例传代，取处于对数生长期3～5代的细胞用于实验。

1. 4实验分组及处理.

1. 4. 1实验分组 实验分五组，分别为空白对照组、UVB照射组( UVB 30m J / cm2辐射40min)、UVB +低剂量黑枸杞水提物组( UVB 30m J/cm2辐射40min +黑枸杞水提物0. 5mg/m L)、UVB +中剂量黑枸杞水提物组( UVB 30m J/cm2辐射40min +黑枸杞水提物1mg/m L)、UVB +高剂量黑枸杞水提物组( UVB 30m J / cm2辐射40min +黑枸杞水提物2mg / m L )。 取对数生长期的Ha Ca T细胞，胰酶消化3min，当细胞变圆、间隙变大时，加入4～5倍的含FBS的DMEM培养基终止细胞消化，将其吹打为细胞 悬 液，调整 细 胞 浓 度 为105个/m L和4×105个/m L，分别接种于96孔板和6孔板中(前者用于MTS实验，后者用于SOD，CAT，GSH-Px，MDA测定)。黑枸杞水提物组于UVB照射前12h加入，空白对照组和UVB模型组只加入相同量的培养基。各组于UVB照射前弃去培养基，加入 少 量的PBS，防止细胞干燥。空白组用锡箔纸遮蔽。将96孔板和6孔板置于UVB灯管的正下方，距离20cm，强度30m J / cm2，辐 照 时 间 为40min。照 射 结 束 后，吸 去PBS，加入新的培养基继续培养20h。

1. 4. 2倒置显微镜下观察各组细胞形态变化

按上述操作完成后，于倒置显微镜观察细胞形态变化及死亡情况。

1. 4. 3 MTS比色法测细胞增殖活力

按上述方法处理细胞后，MTS法测细胞增殖活力。每孔中加入20μLMTS，培养箱中孵育3h后，酶标仪测出各孔在490nm处的吸光度。

1. 4. 4酶生化法测定细胞

SOD活力、GSH-Px含量、CAT活力及MDA含量 按上述方法处理细胞后严格按照说明书检测SOD活力、GSH-Px含量、CAT活力及MDA含量。

1. 5统计学处理

采用SPSS19. 0软件进行统计学分析，计量资料以( x±s)表示，满足正态分布或方差齐性检验，组间比较用单因素方差分析;否则进行秩和检验。多重比较采用LSD-t检验。以P＜0. 05为差异有统计学意义。

2结果

2. 1倒置显微镜下观察各组细胞变化 见图1。UVB照射40min

后，细胞形态模糊不清，并出现细胞死亡成碎片及脱片现象;低剂量水提物组部分细胞形态正常，细胞脱片现象稍有减少，中剂量和高剂量水提物组细胞形态基本正常，细胞脱片现象明显减少。

2. 2 MTS比色法检测细胞增殖活力 见表1。UVB照射组A值较空白对照组降低，差异有统计学意义( P＜0. 05) ; UVB +低剂量水提物组、UVB +中剂量水提物组、UVB +高剂量水提物组A值较UVB照射组升高，差异有统计学意义( P＜0. 05) ; UVB +低剂量水提物组、UVB +中剂量水提物组、UVB +高剂量水提物组相互之间比较差异有统计学意义( P＜0. 05)。2. 3 SOD活力、GSH-Px含量、CAT活力、MDA含量检测结果 见表1。UVB照射组SOD活力、GSH-Px含量、CAT活力较空白对照组降低，MDA含量较空白对照组升高，差异有统计学意义( P＜0. 05) ; UVB +低剂量水提物组CAT活力较UVB照射组降低、MDA含量较UVB照射组升高，差异有统计学意义( P＜0. 05) ;UVB +中剂量水提物组和UVB +高剂量水提物组SOD活力、GSH-Px含量、CAT活力较UVB照射组升高，MDA含量较UVB照射组降低，差异有统计学意义( P＜0. 05) ; UVB +高剂量水提物组SOD活力、GSH-Px含量、CAT活力较UVB +中剂量水提物组升高，MDA含量较UVB +中剂量水提物组降低，差异有统计学意义( P＜0. 05)。

3讨论

在《新编藏医学》《晶珠本草》《维吾尔药志》等医学书籍中都有记载黑果枸杞可治疗心热病、心脏病、月经不调等疾病，且效果显著。现代医学研究证实黑果枸杞含有多种有效成分，包括原花青素、多糖、酚酸、黄酮等成分，具有防癌、提高免疫力、抗氧化、抗衰老、缓解眼睛疲劳等多种功能，是一种安全无毒的“药食两用”的资源。正常细胞有较为稳定的氧化/抗氧化系统，SOD是生物体内最重要的自由基清除剂，其活性高低则反映了机体清除氧自由基的能力。CAT和GSH-Px可清除脂类氢过氧化物和H2O2，使细胞膜的结构和功能免受过氧化物的损伤。当紫外线照射过量时，可通过损伤DNA和生成过多的 ＲOS间接损伤核酸、脂质和蛋白质从而引起光老化、皮肤癌等。ＲOS通过激活凋亡蛋白和影响各种代谢和酶的活性导致组织损伤。MDA是细胞脂质过氧化的终末产物，反映了膜脂质过氧化的程度。

本实验结果显示，30m J/cm2的UVB可造成Ha Ca T细胞形态模糊不清，细胞死亡成碎片及脱片现象严重。无论是低剂量、中剂量、高剂量黑枸杞水提物均可减轻UVB辐射后Ha Ca T细胞形态改变及细胞脱片现象。MTS检测细胞增殖结果显示: UVB +低剂量黑枸杞水提物组、UVB +中剂量黑枸杞水提物组和UVB +高剂量黑枸杞水提物组A值均较UVB照射组升高。说明黑枸杞水提物可以促进Ha Ca T细胞在UVB辐射损伤后的增殖。

本实验结果显示，UVB可降低SOD活力、GSH-Px含量、CAT活力，升高MDA含量。说明UVB可破坏Ha Ca T细胞的氧化防御系统，使细胞清除 ＲOS的能力减弱，造成细胞膜及细胞器的损伤。而UVB +低剂量水提物组CAT活力较UVB照射组降低、MDA含量较UVB照射组升高，提示低剂量水提物不能抑制UVB对Ha Ca T细胞的氧化损伤，可能由于药物孵育时间过短或UVB照射时间过长，但其具体原因有待于进一步研究。中剂量和高剂量水提物均可升高SOD活力、GSH-Px含量、CAT活力，降低MDA含量;且UVB +高剂量水提物组SOD活力、GSH-Px含量、CAT活力较UVB +中剂量水提物组更高，MDA含量较UVB +中剂量水提物组更低，提示中剂量和高剂量水提物均可减轻UVB对Ha Ca T细胞的氧化损伤，并在一定的浓度范围内呈剂量依赖关系。

根据以上实验结果，低剂量黑枸杞水提物不能对抗UVB对Ha Ca T细胞的氧化损伤，而中剂量和高剂量黑枸杞水提物可减轻UVB对Ha Ca T细胞的氧化损伤，并在一定的浓度范围内呈剂量依赖关系。本实验为进一步探讨黑枸杞水提物抑制UVB对Ha Ca T细胞氧化损伤作用研究提供了理论依据。

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