文章转载自：中国医学文摘·皮肤科学2017年第3期

作者：张燕，吕国彦，王涛，刘桂丽，李瑞静，高顺强

敏感性皮肤是一种对外界刺激呈过度反应的特殊皮肤类型，临床表现多样，红斑常见，并伴有不同程度的主观不适。红斑的病理表现是真皮乳头层毛细血管网扩张而产生的红色斑疹。血管内皮生长因子( vascular endothelial growth factor，VEGF) 具有促进血管新生及扩张等作用，在多种组织和疾病中表达。在表皮，VEGF 主要由角质形成细胞分泌。笔者考虑如果能减少 VEGF 的分泌或有效抑制其作用，将会达到改善皮肤泛红的功效。木天蓼 ( actinidia polygama，AP) 即葛枣猕猴桃，属猕猴桃科植物，主要分布于亚洲国家，其枝叶、果实均可入药。据研究，木天蓼中含有生物碱、木天蓼内酯、B-苯乙醇等多种成分，特别是其中的 α-亚麻酸具有抗炎作用，尤其是可以使浮肿明显减轻。本研究着眼于红斑这一敏感性肌肤的典型表现，定位于与血管扩张密切相关的 VEGF，通过体外细胞培养的方法，探讨木天蓼改善皮肤红斑的作用机制，为研发缓解皮肤泛红的新型植物护肤品提供理论依据。

1 材料与方法

1. 1 材料及试剂 人表皮角质形成细胞 ( HEK) 为Cascade Biologics 公司产品，购自北京清源浩生物科技有限公司。胰蛋白酶/EDTA 溶液、胰蛋白酶抑制剂、Eplife 培养基、HKGS 添加剂、青霉素、氯霉素双抗购自美国 GIBCO 公司；VEGF ELISA 试剂盒为 Ｒ＆D Sys-tems 公司产品; 二甲基亚砜( DMSO) 购自北京化工厂。其他试剂: 如十二水磷酸氢二钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾等试剂均为国产分析纯等级。

1. 2 主要仪器 多功能酶标仪 ( Synergy II ) 为美国Biotek 公司产品; 台式离心机为德国 Heraeus 公司产品; CO2恒温培养箱为美国 Sheldon 公司产品; 超净工作台为北京净化设备有限公司产品; 37℃ 恒温水浴箱为温州医疗器械厂产品; 倒置显微镜为日本 Nikon 公司产品。

1. 3 木天蓼提取物的制备

1. 3. 1 木天蓼水溶性提取物( APW) 的制备

取木天蓼生药材 100g 粉碎后浸泡于 1 000m L 双蒸水中，室温过夜，水浴回流提取 2 次，每次 1h，将上清液合并，用2% 活性炭 80℃ 蒸煮 脱色 30min，8 000r / min 离 心10min，取上清液用旋转冷冻蒸发器蒸发干燥，所得粉剂为木天蓼水提取物。4℃保存，使用时用完全培养基稀释成终浓度。

1. 3. 2 木天蓼醇溶性提取物( APE) 制备

取木天蓼生药材 100g 粉碎后放入三角烧瓶中，加入 10 倍体积的 70% 乙醇，室温密闭浸泡 7d，期间每隔 2 ～ 3d 摇晃烧瓶，6 ～ 8 层纱布过滤祛除渣滓，加入 2% 活性炭80℃ 蒸煮脱色，旋转冷冻蒸发器减压蒸发成粉状物，所得干粉为木天蓼醇提取物。使用时首先用二甲基亚砜( DMSO) 稀释成 200mg /m L 的浓缩液，然后用完全培养基稀释成终浓度。

1. 4 细胞培养

配制 HEK 的完全培养基，并加入100U / L 青霉素和 100mg / L 链霉素。将 HEK 于 37℃ ，5% CO2细胞培养箱内用完全培养基培养，适时传代备实验用。实验选用 96 孔细胞培养板，取对数生长期细胞用于实验。将细胞消化后制成细胞悬液，浓度为每孔 3 200 个细胞/200μL 培养基，37℃，5% CO2细胞培养箱内培养，备用于以下实验。

1. 5 木天蓼提取物工作液的配制

将 APW 和 APE分 别 用 完 全 培 养 基 稀 释 为 25μg /m L，50μg /m L，100μg / m L，200μg / m L 浓度。设置阴性对照组 ( 无细胞、无刺激液，仅加完全培养基) 、阳性对照组( 有细胞、用 PBS 替代刺激液，加完全培养基) 、基质对照组( 有细胞、无刺激液，有含 1% DMSO 的完全培养基) 。

1. 6 MTT 法测定木天蓼提取液对 HEK 增殖活力的影响

取对数生长期 96 孔板( 1. 4 来源) 应用于以下实验。弃去旧培养基，将不同浓度的刺激液分别加入96 孔板，放入培养箱中孵育。24h 后终止细胞培养。吸去每孔内的上清液( 保存备测 VEGF 浓度) ，加入10% MTT( MTT ∶ 完全培养基 = 1 ∶ 9 ) 100μL / 孔，37℃ ，5% CO2培养箱培养 2h。酶联免疫检测仪器490nm 及690nm 分别读数，评估 HEK 增殖活力是否受木天蓼工作液影响。

1. 7 ELISA 法测定木天蓼提取物对 HEK 分泌 VEGF的影响

严格按照试剂盒说明书进行操作。

1. 7. 1 不同浓度及种类不同基质的木天蓼提取液对HEK 分泌 VEGF 的影响

加入各种培养基培养 24h后，测定回收的细胞培养基( 1. 6 来源) 中 VEGF 的浓度，并绘制 VEGF 浓度曲线。

1. 7. 2 不同时间内最佳浓度的 APE 对角质形成细胞分泌 VEGF 的影响

选取最佳种类及浓度的木天蓼刺激液( 根据 1. 7. 1 测定结果而定) ，对 96 孔板( 1. 4 来源) 培养的细胞进行刺激实验，分别在 12h，24h，36h收集培养液，测定 VEGF 该时间段的产生量，和对照组相比，计算出VEGF 产生的相对被抑制率，并绘制时间相关曲线。

1. 8 统计学处理

用 SPSS13. 0 软件，数据表示用均数 ± 标准差( x ± s) ，正态分布的多个均数的比较使用析因设计的方差分析( ANOVA) ，不同时间点上均数的比较采用重复测量( repeated measure) 的方差分析，对不满足正态和方差齐性条件的样本量偏小的计量资料，采用 LSD 方法，P ＜ 0. 05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2. 1 MTT 法测定木天蓼提取液对 HEK 增殖活力的影响 见表 1。不同浓度的 APW 和 APE 对 HEK 的增殖活性无明显影响，与对照组相比差异均无统计学意义( F = 0. 973，P = 0. 44) 。

2. 2 木天蓼提取液对 HEK 分泌 VEGF 的影响 见表2，图 1。 在 刺 激 物 浓 度 为 50μg / m L，100μg / m L，200μg / m L时，APE 与 APW 相比，对 VEGF 分泌的抑制能力强，差异具有统计学意义( P = 0. 02) ; 与对照组相比差异亦有统计学意义( P ＜ 0. 01) ; APE 对 HEK 分泌VEGF 的抑制作用具有浓度依赖性。

2. 3 不同时间最佳浓度的 APE 对 HEK 分泌 VEGF的影响

见表 3 ～ 4，图 2。应用 100μg /m L APE 刺激HEK，测定并计算不同时间段 APE 对 HEK 分泌 VEGF的抑制率，不同时间点上均数的比较采用重复测量( repeated measure) 的方差分析，结果显示 APE 对 HEK分泌 VEGF 的抑制具有时间依赖性; 各时间点细胞增殖活力差异无统计学意义( F = 0. 019，P= 0. 90) 。

3 讨论

敏感性皮肤皮肤科常见，易出现红斑、丘疹、脱屑、毛细血管扩张等客观症状。患者常主诉皮肤泛红，烧灼感。皮肤泛红即毛细血管扩张，是皮肤的毛细血管因某种原因持续性扩张而造成的。短时间内的血管扩张可产生一过性的泛红，长期扩张则会产生局部或广泛的红斑。长时间扩张，毛细血管会日渐失去弹性和韧性，越来越难以恢复; 皮肤也会日益敏感脆弱，并加速色斑、皱纹、松弛等老化迹象的产生，严重影响美观。VEGF 是一种非常重要的细胞因子，在表皮主要由角质形成细胞( keratinocyte，KC) 分泌，具有促使血扩张

、增加血管通透性( 作用较组胺强50 000 倍) 等多种生物学作用。其共有 8 种亚型，不同亚型的生物学特性不同，从而导致出现不同的临床表现、病程及预后。如: VEGF165 高表达的黑素瘤细胞，血管增殖明显;而 VEGF121 高表达的黑素瘤则很少形成血管，易发生缺血坏死。就形态学而言，血管扩张的过程中不可避免的发生了血管内皮细胞形态及细胞间连接的变化。与其他亚型相比，VEGF121 促血管扩张及通透性增加的作用更强，且很可能是造成皮肤红斑的主要原因。因此笔者考虑如果能减少 VEGF 的分泌或有效抑制其作用，有望达到改善皮肤泛红的功效。木天蓼 ( actinidia polygama，AP) 属猕猴桃科植物，落叶藤本，主要分布于亚洲国家，其枝、叶、果实均可入药。早在 2003 年韩国学者通过动物模型及体内外试验证明，木天蓼果实的乙醇提取物能够明显抑制乙酸诱导的血管通透性增加，并且呈剂量依赖性，水溶液提取物能明显抑制角叉藻聚糖诱导的小鼠足部的水肿反应。本实验通过 HEK 体外培养技术，采用 MTT 法及ELISA 法检测 AP 提取物对 HEK 的影响。结果发现，与对照组相比，APW 和 APE 对 HEK 分泌 VEGF 均有抑制作用，但APE 的抑制作用更强，且有浓度和时间依赖性。并且发现，即使浓度达到 200μg/m L，木天蓼提取液对 HEK 增殖活力亦无明显影响，因此笔者认为培养基中 VEGF 含量的减少并不是因为细胞数量减少而引起。通过以上结果笔者推断，木天蓼提取液可通过抑制 HEK 分泌VEGF 来减轻血管扩张及通透性增高，从而在一定程度上起到改善皮肤红斑的作用。并且从药物安全角度出发，木天蓼对 HEK 的增殖活性无明显抑制作用。

目前，随着护肤理念由单纯保湿向追求皮肤健康的转变，植物成分的医学护肤品以其疗效稳定，刺激性小以及安全性高的优势，已经成为当今时尚追求和高端美容的体现。希望今后的研究能以此实验结果为契机，研发出木天蓼提取物为主要成分的医学护肤品，用来改善 VEGF 引起的皮肤泛红。

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