本文转自《中国皮肤性病医学杂志2017年01期》

作者张芙蓉，徐宇，刘洋，杨国玲

头癣是头皮及头发的浅部真菌感染，在世界范围流行。近年来随着抗生素的滥用、糖皮质激素及免疫抑制剂的使用使得头癣的发病率逐年上升。大规模流行病学资料显示目前犬小孢子菌成为头癣的主要致病菌。头癣主要发生在儿童，极少部分发生在成人。这可能与儿童头皮组织皮脂腺发育不完全，缺乏抑制犬小孢子菌的功能有关。因头癣预后可引起永久性脱发及萎缩性瘢痕，严重影响患者的身心健康，而目前头癣的发病机制尚不清楚，故明确头癣的致病因子以及发病机制意义十分重大。目前国内外学者一致认为头癣的发病与蛋白酶有关。大量研究发现，此类蛋白酶包括角蛋白酶、弹性蛋白酶、胶原酶、酯酶、神经酰胺酶和磷酸酶等，其中角蛋白酶的致病性比较明确，但是否有其他蛋白酶参与头癣的发病尚不清楚。故本课题组前期研究了犬小孢子菌在不同组织( 成人头皮组织、儿童头皮组织及儿童光滑皮肤组织)诱导下产生的某些蛋白酶导致儿童头癣的发生，运用抑制消减杂交技术构建了犬小孢子菌差异基因文库，从中筛选出与头皮诱导培养相关的 4 个上调表达基因，其中一个与 FSH1 基因高度同源，称为 FSH1 基因。通过实时定量 PCＲ 技术得出 FSH1 基因在儿童头皮组织培养基中较光滑皮肤组织培养基中呈高度上调表达，其中上调倍数 44. 6。通过进一步实验研究，得出犬小孢子菌头癣株 FSH1 mＲNA 表达明显高于体癣株，经儿童头皮或包皮诱导后犬小孢子菌 FSH1 mＲ-NA 表达较诱导前明显升高，再次证实 FSH1 可能与犬小孢子菌的生长和致病性密切相关。因此我们猜测 FSH1 可能是犬小孢子菌所致头癣的致病因子。曾有学者报道丝氨酸蛋白酶与犬小孢子菌入侵、黏附动物的角质细胞有关。

为了进一步明确 FSH1 的致病作用，本文采用 c DNA末端快速扩增( Ｒapid c DNAend amplification，ＲACE) 获取 FSH1 基因的 c DNA 全长序列并对其分析，为进一步探索 FSH1 基因在犬小孢子菌所致头癣中的功能奠定研究基础。

1 材料与方法

1. 1 材料

1. 1. 1 菌种来源

犬小孢子菌标准株( 10394 ) 为大连医科大学附属第一医院皮肤科真菌室购买菌种。

1. 1. 2 试剂

3'-Full ＲACE Core Set with Prime-ScriptTMＲTase、Prime ScriptTMII High Fidelity ＲT-PCＲKit、Tks GflexTMDNA Polymerase、Ta KaＲa Mini BESTAgarose Gel DNA Extraction Kit、5'-Full ＲACE Kit withTAP、DNA Ligation Kit 购自日本 Ta KaＲa 公司，T-Vec-tor p MDTM20、克隆载体 p MDl8-T vector，克隆受体菌E. coli Competent Cells JM109 均购自宝生物( 大连) 有限公司。

1. 2 方法

1. 2. 1 引物设计

根据前期测序得到的FSH1 基因片段、5'及 3'扩增试剂盒中的引物设计原则设计引物序列。所需引物见表 1。

1. 2. 2 犬小孢子菌的培养

将犬小孢子菌标准株接种于葡萄糖琼脂固体培养基中27℃ 活化培养 10 天后，接种于葡萄糖琼脂液体培养基 27℃，150r/min 震荡 10d，用于提取总 ＲNA。

1. 2. 3 犬小孢子菌总 ＲNA 的提取

参照Trizol 试剂盒说明书提取总 ＲNA，用紫外分光光度计测定 A260/A280( 正常值为 1. 80 ～ 2. 00) ，用 1% 琼脂糖凝胶电泳对完整性和有无降解及基因组污染等分析。

1.2. 4全长CDNA的克隆

全长CDNA的克隆分以下几步完成。

1．2．4．1

3'ＲACE按照3'-FullＲACE Core Set withPrime ScriptＲTase反 转 录c DNA， 总 ＲNA lμL，3'ＲACE Adaptor( 5μM) lμL，d NTP mix( 10 m M ) lμL，加入无 ＲNA酶的无菌水至总体积7. 5μL。混匀后65℃ 孵育5 min，迅速置于冰上，短暂离心，然后加入以下组分: 5x Prime SCript Buffer 2μL，Prime SCriptＲTase( 200U/μL ) 0. 25μL，ＲNase Inhibitor ( 40U/μl )0. 25μL，混匀后42℃ 孵育60 min，70℃ 孵育15 min以灭活反转录酶，置于冰上，即为c DNA第一链，用作下一步PCＲ 扩增的模板。使用Tks GflexTMDNA Poly-merase进行PCＲ 扩增。Outer PCＲ 反应体系为: c DNA反应液1μL，2x Gflex Buffer ( Mg2 +，d NTP plus) 25μL，Tks Gflex DNA Polymerase ( 1. 25μ/μL) 1μL，3’ＲACEOuter Primer( 10μM) 2μL，FSH1-F1-YZ Primer( 20μM)1μL，加无菌水至总体积20μL。Outer PCＲ 反应程序为: 94℃1min，( 98℃10s，55℃15s，68℃l min) 30个循环。Inner PCＲ 反应体系为将c DNA反应液换成OuterPCＲ 反应液，FSH1-F1-YZ Primer换成FSH1-F1 Primer即可，经过同样反应条件，取5μL PCＲ 产物进行1%琼脂糖凝胶电泳。剩余PCＲ 产物按照Ta KaＲa Mini BESTAgarose Gel DNA Extraction Kit切胶回收目的条带。

1．2．4．2

5'ＲACE按照Ta KaＲa 5'-FullＲACE Kitwith TAP使用说明书进行，对TotalＲNA进行CIAP、TAP处理，并与5'ＲACE Adaptor连接后，反转录合成c DNA。反应体系为LigatedＲNA 6μL，Ｒandom 9 mers( 50μM) 0. 5μL，d NTP Mixture (每个10 m M) 1μL，加入 ＲNase Free d H2O至7. 5μL，70℃10 min，立即在冰上放置2min。再在上述变性、退火后反应液加入下列组分: 5* M-MLVBuffer 2μL，ＲNase Inhibitor( 40U /μl)0. 25μL， Ｒeverse Transcriptase M-MLV( 200U /μL) 0. 25μL，反应条件:42℃60 min，30℃10 min，70℃15min。将所得的c DNA进行PCＲ 扩增，条件与3’ＲACE相同，仅引物在Outer PCＲ 反应体系中换成5’ＲACEOuter Prime，FSH1-Ｒ1-YZ Prime，在Inner PCＲ 反 应 体 系 的 引 物 换 成FSH1-Ｒ1 Prime。 所得的PCＲ 产物用Gel Extraction Kit试 剂 盒 回 收。使 用Ta KaＲa DNA Ligation KitVer.2. 1中的连接酶，将上述PCＲ 产物与T-Vector p MDTM20连接后，热转化至E．Coli Competent Cells JM109中，涂布平板，37℃ 过夜培养。挑选阳性菌落，提取质粒进行测序。

1．2．4．3 ＲACE序列验证

使用Tks Gflex DNA Polymerase进行PCＲ扩增，PCＲ 反 应 体 系 为: 3’ＲACEPCＲ 反 应 液1μL，2x Gflex Buffer( Mg2 +，d NTP plus) 25μL，Tks GflexDNA Polymerase( 1. 25u /μL) 1μL，3’ＲACE YZF1 ( 20μM) 1μL，3’ＲACE YZＲ1 Primer( 20μM) 1μL，加无菌水至总 体 积21μL。PCＲ 反 应 程 序 为: 94℃1 min，( 98℃10S，55℃15 S，68℃l min) 35个循环。将所得PCＲ 产物进行第二轮扩增，将引物3’ＲACE YZF1改成3’ＲACE YZF2，其余反应产物及反应条件均不变。所得PCＲ 产物纯化，克隆扩增及测序。

2结果

2. 1

犬小孢子菌总ＲNA用紫外分光光度计测得的OD260与OD280的比值，约为1. 6，表明 ＲNA的纯度较好。ＲNA电泳结果28 S与18 S条带的亮度比值为2∶1，5 S的亮度较弱(图1 )，表明所提取的总 ＲNA完整，降解少。

2.2

3'ＲACE和5'ＲACE扩增产物的电泳检测 根据测序结果，设计 ＲACE反应的特异引物，对获得的3'ＲACE和5'ＲACE序列进行琼脂糖凝胶电泳检测。结果如图2和3所示，FSH1基因的3’ＲACE和5’ＲACEPCＲ 序列长度分别约为730bp和450bp。

2. 3

FSH1基因3'ＲACE和5'ＲACE扩增产物测序与全长序列验证3'ＲACE和5'ＲACE扩增产物经过纯化、克隆、测序，得到3'ＲACE和 5'ＲACE序列长如图4所示，总长度为约820bp，可以证明5'ＲACE和3'ＲACE产物来源于一条mＲNA链且包含CDS大多数序列。

2. 4

FSH1基因全长c DNA序列分析 对 获得 的FSH1基因序列分析发现，该基因核苷酸序列全长为945bp，开放阅读框( OＲF)长度为831bp，编码276个氨基酸，包含44bp的5' UTＲ，70bp的3' UTＲ。通过BLAST同源性分析，得出与犬小孢子菌的结构域蛋白同源性达100%，与石膏样小孢子菌结构域蛋白同源性达78%。

3讨论

FSH1基因是犬小孢子菌中一个新的基因。其编码丝氨酸水解酶，包含一个Ser/His/Asp活性位点，属于多功能 αβ 水解酶超家族。Simon等通过活性位点和其它蛋白结构的分析，表明FSH1是一个酯酶、肽酶、酰胺酶等，能够水解疏水磷酸酯、油酯化合物。Baxter等通过计算机合成及蛋白组学的方法分析了FSH家族，得出其家族庞大，功能较多，在啤酒酵母菌和其它有核生物中分离出的FSH家族基因有46种，在啤酒酵母菌中就有15种。在啤酒酵母基因文库中不同的丝氨酸水解酶有不同的功能:包括蛋白酶作用，可以分解蛋白，使其变为单个氨基酸和寡肽;在内源性信号因子的新陈代谢中的酰胺酶作用，调控新陈代谢;在药物代谢中的羧酸酯酶作用等。在前期头癣发病机制的研究中得出一个可能的致病因子即FSH1基因编码的蛋白酶，鉴于FSH1蛋白酶功能如此强大，故进一步研究FSH1基因的功能及其在头癣中的发病机制可行性较大。

本实验采用ＲACE技术成功对FSH1基因片段5'端扩增出一条196bp大小基因，3'端扩增出一条496bp大小基因，并根据3'ＲACE产物扩增全长得到目的片段945bp，其开放阅读框长度为831bp，编码276个氨基酸，序列分析表明其5'端非编码区大小为44bp，3'端非编码区大小为70bp。通过BLAST同源性分析，得出与犬小孢子菌的结构域蛋白同源性达100%，与石膏样小孢子菌的结构域蛋白同源性达78%。经查阅文献尚未见到有关真菌结构域蛋白的相关报道。

随着分子生物学的进步，目前对于新基因的研究方法较多。例如基因沉默、基因敲除技术越来越多地被成功应用于皮肤癣菌的未知致病因子研究。Shi等发现Sub6可能是须癣毛癣菌的致病因子，即利用基因干扰技术对Sub6进行功能研究，得出Sub6基因干扰后菌株的致病性减弱，引起超敏反应的细胞因子水平降低。因此本研究通过扩增FSH1新基因的全长，为将来深入研究犬小孢子菌FSH1基因的功能及其在头癣发病中的机理奠定了基础，为将来新药靶位研究提供了相关的理论根据。

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