文章转载自：中国皮肤性病医学杂志2017年07期723页
作者：盛晚香，张丽芳，吴剑波
［摘要］细胞的新陈代谢过程存在着蛋白质等大分子的合成与降解以及细胞器的更新，降解细胞内物质的途径有两条: 一个是通过蛋白酶体( proteasome) ，一个就是自噬( autophagy)。有学者提出，细胞自噬是细胞在恶劣条件下确保其生存的基本应激反应，可以作为细胞对环境适应的一种保护机制，防止或减轻损伤的产生。
PM2. 5 指空气动力学直径≤2. 5μm 的 PM，目前，已有大量研究显示: PM2. 5 对肺泡巨噬细胞、血管内皮细胞均可诱导其自噬水平的发生，那么，作为人体最大器官—皮肤，PM2. 5 对其是否也存在类似的毒性效应呢? 本研究通过采用不同浓度及成分的 PM2. 5处理人皮肤角质形成细胞，观察与自噬相关的生物学标志物表达情况，并研究其诱导自噬的可能机制。
［关键词］细胞、PM2. 5、自噬水平、皮肤
1. 1 材料及试剂 人永生化表皮细胞株 Ha Ca T 购自于中国典型培养物保藏中心( 武汉大学) 。PM2. 5 采集地点: 中国地质大学( 武汉) 环境学院大气研究所楼顶，距地面 6 米。具体采集工作由中国地质大学( 武汉) 环 境 学 院 协 助 完 成。微 管 相 关 蛋 白 1 轻 链 3( LC3) 兔抗人多克隆抗体( 美国 Cell Signaling 公司) ，小鼠抗 β-actin(武汉博士德生物工程有限公司) ，BCA蛋白浓度测定试剂盒、蛋白酶抑制剂及 ＲIPA 裂解液( 江苏碧云天生物技术研究所) ; 免疫荧光用山羊抗兔Ig G、山羊抗兔 HＲP 标记二抗( 武汉博士德生物工程有限公司) ，BX53 型荧光显微镜( 日本奥林巴斯公司) 。
1. 2 染毒液制备及分组 称取一定重量的 PM2. 5 粉末，加入到 0. 9% 生理盐水中，配制成浓度为 1 000μg /m L 的母液，充分混匀，13 000 g / min 离心 30 min，取其上清液作为浓度 1 000μg /m L 的 PM2. 5 水溶性成分储备液。同样的方法取其沉淀物，作为浓度
1 000μg /m L的 PM2. 5 非水溶性成分储备液。染毒液预设浓度为:0. 1μg / m L，1μg / m L，10μg / m L 及 100μg / m L。染毒液干预的细胞为实验组，分为 A 组( PM2. 5 水溶性成分) ，B 组( PM2. 5 非水溶性成分) 。根据浓度分为 A1组( 0. 1μg /m L) 、A2 组( 1μg /m L) 、A3 组( 10μg /m L) 、A4 组( 100μg / m L) 及 B1 组( 0. 1μg / m L) 、B2 组( 1μg /m L) 、B3 组( 10μg / m L) 和 B4 组( 100μg / m L) 。
1. 3 细胞培养及分组 将 Ha Ca T 细胞常规培养于含10% 胎牛血清的 DMEM 高糖培养基中，37℃ ，5% CO2，湿度相对饱和的细胞培养箱，2 ～ 3d 换液 1 次，常规传代培养，选取生长状态良好的对数期细胞进行实验。实验组将生长良好的 Ha Ca T 细胞分别用 A，B 组不同浓度的 PM2. 5 处理后 37℃ 无菌培养箱孵育 24h。同时设空白对照组。
1. 4 免疫荧光染色检测LC3 的表达 取上述各实验组细胞，在培养板中将已爬好细胞的玻片用 PBS 浸洗3 次，每次 3min，4% 多聚甲醛固定，室温 15min。加入含有 0. 5% Triton X-100 的 PBS，室温通透 20min; PBS浸洗 3 次后吸干，在玻片上滴加正常山羊血清，室温封闭 30min; 吸水纸吸掉封闭液，不洗，每张玻片滴加足够量的稀释好的一抗 LC3( 1∶ 500) 并放入湿盒，4℃ 孵育过夜; 移除一抗，PBS 漂洗 5min，重复 3 次。山羊抗兔 Ig G 二抗( 1∶ 100) 室温孵育 1h。移除二抗，PBS 漂洗 3min，重复 3 次。DAPI 溶液( 1∶ 400) 染核，避光室温孵育 5min，PBS 漂洗 5min，重复 4 次，移除。将 PBS封闭的孔板放置在实验室奥林帕斯 BX53 倒置荧光显微镜下拍照成像，观察实验结果。
1. 5 Western 印迹检测 LC3-II / I 变化 取上述各实验组细胞，4℃预冷，PBS 漂洗 3 次，加入适量细胞裂解液( ＲIPA) 和蛋白酶抑制剂( PMSF) ，比例按 1∶ 100 配置，冰上超声裂解 30min，吸取上清液移至 1. 5m L 离心管中，BCA 试剂盒测定蛋白浓度，SDS-PAGE 电泳分离，转移至硝酸纤维素膜，室温封闭 2 h，一抗 LC3 ( 1 ∶1 000) 和 β-actin( 1∶ 200) 4℃ 孵育过夜，HＲP 标记二抗( 1∶ 50 000) 室温孵育 2h，最后经 ECL 化学发光法显色，计算机扫描 PVDF 膜。每组实验重复 3 次。以 β肌动蛋 白 的表 达 做 内参，用 Band Scan 分 析 胶 片 灰度值。
1. 6 统计学处理 所有数据应用 SPSS20. 0 统计学软件进行分析，本研究中的计量资料以均数 ± 标准差( x± s) 表示，两样本间的均数比较采取 t 检验，而多样本间均数比较则应用单因素方差分析，以 P ＜0. 05 表示差异有统计学意义。
2. 1 细胞免疫荧光染色结果 见图 1。在对照组中LC3 呈 极 微 弱 而 少 的 表 达，而 经 0. 1，1. 0，10. 0 ，100μg / m L 不同浓度及成分 PM2. 5 处理的实验组细胞在荧光染色后呈现阳性甚至强阳性表达，且红色荧光强度随着毒液浓度增加而增强，自噬水平明显增高。在相同浓度下，A，B 各组红色荧光强度差异无统计学意义。
2. 2 免疫印迹检测结果 见 表 1，图 2，3 所 示。PM2. 5 干预细胞 24h 后，A1 ～ A4 组及 B2 ～ B4组细胞随着 PM2. 5 作用浓度的递增，细胞中 LC3-II 蛋白表达水平逐渐升高，且均明显高于对照组( A 组 t = 5. 38，11. 06，23. 07，11. 84，B 组 t = 2. 77，4. 24，8. 83，14. 88;P ＜ 0. 05) ; B1 组也较对照组增高，但两者相比差异无统计学意义( t = 2. 77，P = 0. 05) 。在相同浓度下，A1组细胞蛋白表达水平高于 B1组( F = 0. 42，P ＞ 0. 05) ;A2 组细胞蛋白表达水平高于 B2 组 ( F = 1. 85，P ＞0. 05) ; A3 组细胞蛋白表达水平高于 B3 组( F = 3. 96，P ＞ 0. 05) ; A4 组细胞蛋白表达水平高于 B4 组 ( F =5. 19，P ＞ 0. 05) 。
细胞自噬是细胞内一种保守的蛋白降解通路，系指隔离膜包裹细胞质和( 或) 细胞器形成自噬体，然后与溶酶体融合形成自噬溶酶体并在其中发生降解的过程。它的发生由一组自噬相关蛋白( autophagy-relatedproteins，Atg) 所介导，其中，Beclin 1，LC3β ( 或 LC3β-II) 及 P62 蛋白水平的改变是反映自噬发生及强度的代表性指标。当细胞处于应激状态如饥饿、营养匮乏、缺氧、细胞发育过程中其结构重建及细胞器损伤等条件下时，细胞自噬水平会升高。研究表明，自噬既可促进机体健康，又与肿瘤、感染性疾病、肺部疾病、神经退行性疾病、心肌病、衰老及老年病等有密切关系。
图 1 LC3 免疫荧光染色图 ( × 400)
Fig. 1 LC3 immunofluorescence staining ( × 400)
表 1 各组 LC3 Ⅱ/Ⅰ Western blotting 实验结果 ( x ± s)
Tab. 1 The Western blotting results of LC3Ⅱ / Ⅰ each group ( x ± s)
大量研究发现，PM2. 5 可对人体呼吸、心血管、内分泌等多系统产生毒性作用。皮肤作为人体最大的器官，直接暴露于体表，与大气污染物接触，是外源毒性物质作用的重要靶器官，但目前关于 PM2. 5 对皮肤毒性作用的研究为之甚少。Magnani 等用透射电子显微镜研究了 CAPs 和皮肤组织超微结构之间的相互作用，以 100 mg CAPs/m L 干预重构人表皮( recon-structed human epidermis，ＲHE) 24h 后观察到 CAPs 出现在 ＲHE 近角质层的上层细胞，48h 后出现在更深层细胞，证明 PM2. 5 可经皮肤直接吸收。那么，当人表皮角质形成细胞暴露于PM2. 5 的环境下，是否会诱导表皮细胞自噬的发生? 如果有，那么自噬水平的变化对人角质形成细胞有什么作用及其可能发生什么机制? 针对这些问题本研究利用免疫荧光染色、West-ern-blot 检测技术，定性分析人表皮角质形成细胞中自噬体数量的变化，定量分析自噬相关蛋白 LC3 表达的变化。
目前可采用的检测自噬的方法较多，其中，LC3( 微管相关蛋白 l 轻链 3) 是目前检测细胞自噬的标志蛋白，LC3-I 分子量为 18k D，分布在细胞质上; LC3-II分子量为 16k D，当细胞自噬发生时，自噬体形成增多，LC3-I 被特异的剪切成 LC3-II，并转移到自噬体上。所以，通常可以检测 LC3-I 向 LC3-II 的转换来确定细胞自噬的发生。通过免疫荧光染色法定性分析，发现对照组中 LC3 蛋白呈极微弱而少的表达，而经 PM2. 5诱导的实验组细胞在荧光染色后呈阳性甚至强阳性表达，且呈浓度依赖性升高。笔者进一步通过免疫印迹法进行定量分析发现，A1 ～ A4 组及 B2 ～ B4 组细胞随着 PM2. 5 作用浓度的增高，细胞中 LC3-II/I 蛋白比值逐渐升高，且均明显高于对照组( P ＜ 0. 05) ; 相同浓度下，PM2. 5 水溶性成分及非水溶性成分作用强度无明显差异。这些实验结果不仅证实 PM2. 5 能诱导人表皮角质形成细胞发生自噬，通过分解自身细胞器和蛋白质，来维持细胞内环境稳态，而且随着其浓度的升高，人角质形成细胞的自噬活性也随之增强。B1 组较对照组细胞 LC3-II 蛋白水平虽无统计学意义，但表达呈轻度升高，提示角质形成细胞经过 PM2. 5 诱导后有自噬现象发生。同时我们通过荧光显微镜观察到在最大浓度( 100μg /m L) PM2. 5 毒液处理后的实验组细胞，细胞数目明显减少，胞膜不完整伴胞核碎裂，细胞状态差，细胞趋向于凋亡。这与
Milan 等用共聚焦电子显微镜观察到经 UV 辐照后的人角质形成细胞发生自噬的表现特征相似，并提出这一现象的发生可能是角质形成细胞为对抗 UV-诱导细胞凋亡的一种自我保护机制。
Li 等最新研究发现在暴露 PM2. 5 尤其是其金属成分 A1 和 Pb 中，会引起人肺泡上皮细胞模型中miＲ-4516 及其靶基因 ＲPL37 表达水平的变化并出现细胞核糖体功能紊乱与自噬的同时发生，另外，也提出了在细胞中 ＲPL37 的消耗增加了 LC3-II 的表达，从而推断miＲ-4516 / ＲPL37 通路可能介导了人肺泡上皮细胞中 PM2. 5 暴露-诱导自噬的发生。Deng 等通过透 射 电 子 显 微 镜、PCＲ、Western-blot 方 法 证 实 了PM2. 5 可能通过诱导 ＲOS 产生和引起抗氧化剂活性的丢失，使人肺泡上皮细胞内 ＲOS 积聚和细胞死亡，从而推断了 PM2. 5-氧化应激损伤在诱导细胞自噬中发挥了重要作用。尽管目前关于 PM2. 5 对皮肤自噬作用及其机制的研究甚少，但通过本研究结果可推测 PM2. 5 诱导人皮肤角质形成细胞发生自噬可能是细胞为对抗氧化应激损伤和细胞凋亡的一种自我保护机制。至于国外研究的 miＲ-4516 / ＲPL37 通路，它是否也参与了人皮肤角质形成细胞自噬机制的发生，有待后续进一步研究明确。
图 2 LC3-Ⅱ/Ⅰ蛋白表达
Fig. 2 LC3Ⅱ / Ⅰprotein expression
图 3 实验组与对照组细胞内 LC3-Ⅱ/Ⅰ蛋白水平比较
Fig. 3 Comparison of LC3-Ⅱ / Ⅰ protein levels between the ex-perimental group and the control groupNote: Compared with control group，* P ＜ 0. 05; Compared with thesame concentration of PM2. 5 water-soluble extracts，#P ＞ 0. 05
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