1. 1 对象 临床及病理确诊的皮肤淀粉样变患者 22例均来自 2012 年 3 月 － 2015 年 3 月本科门诊，年龄25 ～ 82 岁，平均( 38. 2 ± 16. 2) 岁，男 12 例，女 10 例，病程 6 个月 ～ 30 年。3 个月内未使用皮质类固醇激素、免疫抑制剂类药物; 对照组 16 例健康志愿者的皮肤组织，正常对照组与患者性别、年龄匹配。所有患者均签署知情同意书后，取躯干或四肢皮肤淀粉样变皮损标本经石蜡包埋，普通 HE 染色病理检查确诊并做免疫组化检查; 其中 12 例患者皮损的一半标本和 10例正常对照皮肤的一半标本先放入液氮快速致冷后再冻存于-70℃备用。本研究通过北京大学人民医院伦

理委员会审批，所有研究对象均签署知情同意书。

1. 2 材料 兔抗人 TＲPV1 多 克 隆 抗 体 购 自 美 国Chimicon 公司，即用型 SP 试剂盒和 AEC 显色试剂盒购自北京中山生物技术公司，引物由北京赛百胜生物有限公司合成，cDNA 合成试剂盒购自美国Fermentas公司。

1. 3 从皮肤组织提取总 ＲNA，合成 cDNA 皮肤标本置液氮中，用锤子砸碎或用研钵研碎皮肤组织，100mg 组织加入 lm L Trizol 试剂; 用 Trizol 液分别从已粉碎的皮肤组织中提取总 ＲNA，按 Trizol 试剂盒(美国Invitrogen 公司) 说明操作。

1. 4 半定量 ＲT-PCＲ 检测 引物序列如下: 内 参GAPDH 上游引物: 5 ’- GAG TCC ACT GGC GTC TTCAC -3’，下游引物: 5’- GTT CAC ACC CAT GAC GAACA -3 ’，扩 增 产 物 120bp; 反 应 条 件: 94℃ 预 变 性5min，94℃ 45 s，60 ℃ 45s，72℃ 1 min，共 30 个循环，最后延伸 72 ℃ 10min; TＲPV1 上游引物: 5’-CTGCTG CTG GCC TAT GTA ATT CT -3 ’，下游引物: 5 ’-TTC TCC GTG TCC AGG ATG GT -3 ’，扩 增 产 物145bp。反应条件: 94℃ 预变性 5min，94℃ 45 s，62℃45s，72℃ 1 min，共 35 个 循 环，最 后 延 伸 72 ℃10min。不加引物或模板的扩增体系作为阴性对照，PCＲ 产物以 2% 琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭显色，凝胶成像扫描系统分析 DNA 荧光强度值，TＲPV1 的 PCＲ产物的信号强度与 GAPDH 信号强度校正后，再计算靶基因 mＲNA 表达强度升高或降低的百分比。

1. 5 免疫组化检测靶基因的蛋白质表达 连续切取4μm 石蜡切片，二甲苯脱蜡 2 次，PBS 洗，TＲPV1抗体4℃ 过夜，采用即用型 SP 试剂盒，AEC 显色试剂盒进行免疫组化染色检测 TＲPV1 蛋白表达。结果判定: 显微镜下观察并留取相片，以角质形成细胞胞浆及胞膜染成红色颗粒为阳性。应用显微图像分析系统，对切片着色强度进行评估，获得平均光密度值( OD) 。所有组织切片与免疫组化结果由两位病理科医师进行盲法评估。

1. 6 统计学处理 采用 SPSS17. 0 统计软件，实验数据以均数 ± 标准误( x ± s) 表示，两组均数之间的比较用 Sutdent's t 检 验，P ＜ 0. 05 为 差 异 有 统 计 学意义。

2. 1 半定量 ＲT-PCＲ 检测 见图 1。用 ＲT-PCＲ 对 12例临床及病理组织检查确诊的皮肤淀粉样变皮损和10 例正常对照皮肤组织进行了 TＲPV1 的 mＲNA 半定量检测，结果显示皮肤淀粉样变皮损中 TＲPV1 的 mＲ-NA 水平 较 正 常 皮 肤 表 达 增 高，为 正 常 对 照 组 的( 136. 82 ± 5. 58) % 。两组TＲPV1 表达差异有统计学意义( t = 28. 678，P ＜ 0. 05) 。

3. 2 免疫组化 见图 2，表 1。对 22 份皮肤淀粉样变患者皮损和 16 份正常对照皮肤标本进行了 TＲPV1 免疫组化染色分析，正常皮肤的表皮角质形成细胞、真皮中平滑肌细胞、汗腺、皮脂腺细胞及血管内皮细胞均有TＲPV1 表达。TＲPV1 在正常皮肤呈低至中度表达在皮肤淀粉样变皮损中呈高度表达; 皮肤淀粉样变皮损组与正常皮肤组 TＲPV1 表达差异有统计学意义( P ＜0. 05) 。

皮肤淀粉样变是一种临床上常见的淀粉样蛋白沉积在皮肤内的慢性炎症性皮肤病，分为原发性和继发性两型，原发性皮肤淀粉样变又分为常见的苔藓样、斑状和少见的结节型皮肤淀粉样变，目前本病的确切病因和发病机理仍未完全阐明。辣椒素受体( TＲPV1)是一种非选择性的阳离子通道，TＲPV1 在皮肤组织的多种细胞上有表达，近期多篇研究报告提示 TＲPV1涉及皮肤生理和病理功能。

辣椒素受体作为一种非选择性的阳离子通道蛋白，广泛分布于皮肤传入神经中的 C 纤维，激活此受体后可引起 Ca2 +、Mg2 +等离子内流，并进一步使C 类神经纤维分泌 P 物质( substance P，SP) 及降钙素基因相关肽( CGＲP) ，而 P 物质的释放可驱动肥大细胞释放TNF-α、组胺、白三烯 B4、前列腺素，进一步介导瘙痒反应的发生，故辣椒素受体在瘙痒机制中起着重要作用。临床上发现 TＲPV1 的激动剂辣椒素能治疗慢性炎症性皮肤病( 如银屑病、皮肤瘙痒症、结节性痒疹、带状疱疹后遗神经痛等) ，但其机制不明。为探讨 TＲPV1 在皮肤淀粉样变皮损发病中的作用，我们选取临床和病理确诊的皮肤淀粉样变患者的皮损，检测皮损中 TＲ-PV1 的基因表达和蛋白表达变化，发现在皮肤淀粉样变皮损部位，TＲPV1 的 mＲNA表达水平和组化检测的蛋白表达水平，较正常人皮肤明显增高( P ＜ 0. 05) ，这

提示 TＲPV1 参与了皮肤淀粉样变皮损的形成。

皮肤淀粉样变在临床上好发于中青年，中国、东南亚地区及南美洲高发，主要表现为淀粉样蛋白在皮肤真皮乳头的异常沉积，临床常表现为褐色丘疹或结节，常伴剧烈瘙痒。而除家族性原发性皮肤淀粉样变已找到致病基因外，其病因尚未明确，但部分研究人员推测有以下几种可能性: ①角质形成细胞凋亡后形成早期阶段的淀粉样蛋白; ②EB 病毒感染后，刺激角质形成细胞分泌淀粉样物质; ③长期瘙痒引起搔抓及摩擦，可刺激淀粉样蛋白的沉积。目前，关于皮肤淀粉样变及其瘙痒机制仍无较多的相关研究。瘙痒是皮肤淀粉样变的主要症状，目前发现有特异的神经传导通路及介导瘙痒物质参与瘙痒的发生。瘙痒的传导通路，由外在或内在介质刺激瘙痒感受器( 真皮及表皮连接处的游离神经末梢) 后，由 C 类神经纤维传导至背脊神经根后上传至大脑，大脑多区域同时发生兴奋，产生痒觉并引起搔抓反应。TＲPV1主要分布在 C 类神经纤维，可被热刺激、酸刺激及香草类化合物激活，C 类神经纤维被激活后可使感觉神经分泌颗粒内的 P物质及降钙素基因相关肽( CGＲP) 等神经肽释放，而 P 物质的释放可驱动肥大细胞释放TNF-α、组胺、白三烯 B4、前列腺素，进一步介导瘙痒反应的发生。临床上长时间局部应用 TＲPV1 激动剂( 如 CAPSAICIN)，可逐渐使 C 纤维中的 P 物质耗竭，减少肥大细胞脱颗粒后介导的一系列瘙痒反应。

目前辣椒素受体在瘙痒性疾病中的研究主要为结节性痒疹及特应性皮炎，但在皮肤淀粉样变的研究在国内外均为空白。在结节性痒疹研究中，部分研究发现神经生长因子( NGF) 在结节性痒疹患者皮损区比正常皮肤表达明显增多，而神经表达的 NGF 上升，可使 TＲPV1 表达增加并导致神经细胞增殖，降低机体对痒感的阈值，使介导瘙痒的受体表达上调，瘙痒介质的生成增加及持久的炎症反应。Stander 等研究发现，在结节性痒疹的瘙痒性皮损，表皮角质形成细胞和神经纤维的 TＲPV1 表达显著增加，外用辣椒素后表达恢复正常。对结节性痒疹患者外用辣椒素进行治疗，除可引起烧灼感及红斑轻微不良反应外，经测试的患者皮损及瘙痒感均逐渐消退，但高使用频率和停药之后的高复发性，不便于临床上大范围使用。特应性皮炎是一个慢性炎症性疾病，临床表现为长时间的瘙痒，皮疹表现可以为红斑、抓痕、苔藓样变、皮肤干燥，常伴有血清 IgE 的上升及家族过敏性鼻炎及哮喘史。在特应性皮炎发展过程中，皮肤干燥及屏障功能下降与其发展有密切关系。Denda M 等发现应用 cap-sazepine( 抗辣椒碱，一种 TＲPV1 拮抗剂) 可加速皮肤屏障功能恢复，Yun 等［20，25］应用 PAC-14028 ( TＲPV1拮抗 剂) ，能 有 效 降 低 由 尘 螨 提 取 粉 ( dermatopha-goides) 及恶唑酮( oxazolone) 在 NC / Nga 小鼠皮肤上所致的特应性皮炎样症状，PAC-14028 能加速胶带撕贴试验后造成皮肤屏障功能破坏的修复。上述研究表明，TＲPV1 表达增加可能会增加瘙痒介质的生成和加重炎症反应，而 TＲPV1 拮抗剂不但可以减轻特应性皮炎症状，还可以促进皮肤屏障功能恢复。

已有研究发现，在几种不同的皮肤病中( 包括结节性痒疹、酒糟鼻、带状疱疹) ，表皮中的 TＲPV1 表达增高，这些研究证明 TＲPV1 与 这 些皮肤 病 的 发 生 有关［22，26-27］。本研究中，笔者发现 TＲPV1 在皮肤淀粉样变中的表达高于正常皮肤，且表达于表皮全层，而正常皮肤 TＲPV1 均为低至中度表达，我们分析辣椒素受体在皮肤淀粉样变皮损中表达升高，可能会增加瘙痒介质的生成及加重炎症反应，造成患者长期搔抓，进一步诱发角质形成细胞分泌或形成淀粉样蛋白，并加重皮肤淀粉样变的发生及发展。但辣椒素受体是否为介导患者剧烈瘙痒的最主要原因，仍需进一步研究辣椒素受体和其他瘙痒介质、受体及炎症因子在皮肤淀粉样变中的作用机制。

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